随后用碘液0.03% (W/V)涂布琼脂淀粉板，发现有β-淀粉酶活力的地方会产生透明圈，初筛的标准是根据透明圈的大小来判断的。选择突变体BFA酶活高于或等于野生型的，然后接种于96深孔板进一步筛选。最后通过96-孔板DNS法定量测定突变体BFA的酶活，选择出酶活大于或者等于野生型的突变体用于复筛分析。
野生型和突变体β-淀粉酶的诱导表达和分离纯化
将带有重组质粒pET-bfa的大肠杆菌在37 ℃、200 r/min的条件下摇瓶培养LB种子(Kan，30 μg/mL) 8–10 h，然后吸取种子培养基2.5 mL接种到50 mL的TB发酵培养基中。在37 ℃、200 r/min的条件下摇瓶培养2 h后加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG，最后转移摇瓶至25 ℃、200 r/min继续培养48 h。发酵液于8 000 r/min、4 ℃下离心20 min收集上清液。
向上清液中加入研磨之后的硫酸铵至终浓度为45% (W/V)，混合物于4 ℃下过夜培养并用磁力搅拌器不断搅拌，确保沉淀完全。然后将混合物在4 ℃、8 000 r/min离心20 min收集沉淀，并用20 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.5)悬浮，过夜透析。
样品加载到用20 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液平衡的SuperdexTM 200 10/300 GL凝胶柱上，在0.5 mL/min的流速下使用上述缓冲液进行洗脱、收集纯化样品。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，12%聚丙烯酰胺)检测目的蛋白的纯度和分子量。
酶活力的测定
β-淀粉酶活力分析是通过测定水解淀粉所释放的还原糖的量。反应体系的混合物包括：0.5 mL 2% (W/V)的可溶性淀粉，0.4 mL 50 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)，并将酶液稀释成适宜的浓度添加至最后体积为1 mL。
在55 ℃下反应10 min之后，向1 mL的混合体系加入1 mL 3, 5-二硝基水杨酸(DNS)终止反应。混合物在沸水中煮沸5 min发生显色后立即于冰浴上冷却，然后补加去离子水至最后体积为12 mL，最后在540 nm下检测上述溶液的吸光值；并以相同条件下缓冲液的测定作为空白对照。
上述条件下，每分钟生成1 μmol/L麦芽糖所需要的酶量定义为1个酶活单位(U)。
野生型和突变体β-淀粉酶的动力学参数
在55 ℃、pH 7.0的条件下以不同浓度的可溶性淀粉作为底物(1–30 mg/mL)，通过上述DNS法测定纯化后的野生型和突变体酶的动力学参数。使用GraphPad Prism 6.0软件将获得的数据拟合到Michaelis-Menten方程，得出Km和kcat值。计算野生型和突变体的kcat/Km，并比较结果。
野生型和突变体β-淀粉酶最适温度及热稳定性的分析
纯化后的酶液分别在不同的温度范围内(30–70 ℃)测定β-淀粉酶活力，以最高的酶活力为100%，从而确定出野生型和突变体β-淀粉酶的最适温度。
在55 ℃下将纯化后的β-淀粉酶保温在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)中，于不同的时间范围内(10–70 min)分别取出样品并冰浴10 min，同时在不同温度下保温10 min，测定酶活力丧失50%时的温度，即酶的半失活温度T50。按照上述的DNS法测定残留酶活，并以未处理的酶活为100%，用作测定野生型和突变体β-淀粉酶的半衰期。
野生型和突变体β-淀粉酶的最适pH分析
在pH 4.0–9.0的柠檬酸缓冲液中分别将两种酶稀释一定倍数，以上述分析的最适温度为条件测定β-淀粉酶酶活力，以最高的酶活力为100%，从而确定出野生型和突变体β-淀粉酶的最适pH。
野生型和突变体的三维结构分析
使用SWISS-MODEL数据生成野生型和突变体BFA的三维结构模型，并且以同源性最高的蜡状芽孢杆菌β-淀粉酶(1j10.1.A，PDB)为模板。借助PyMol 软件分析所有的蛋白质结构模型和图形特征。
