海南大学食品学院郗恩光、杨劲松和海南大学材料与化工学院谭海生等人拟利用MRS选择性培养基，从海南省五指山野生香蕉植株上分离出乳酸菌菌株，对其进行纯化、鉴定。对特殊乳酸菌进行16S rDNA序列同源性分析，构建系统发育树。16S rDNA序列同源性分析就是一种分子水平上鉴定乳酸菌菌种的手段，这种鉴定方法能够从分子和基因水平上认识乳酸菌在香蕉植株上各个部位的多样性及种群结构。海南省五指山地区冬暖夏凉，不受寒潮侵袭，也不受台风影响。由于独特的气候条件，使海南省五指山生物种类繁多，为扩大植物源乳酸菌菌种库提供了有力的条件。
1、 微生物菌群的测定结果
样品中乳酸菌总数在106～107 CFU/g之间，好氧细菌总数在105～107 CFU/g之间，霉菌总数在103～106 CFU/g之间，酵母总数在102～103 CFU/g之间，芽孢杆菌在102～104 CFU/g之间。样品微生物菌群中乳酸菌属于优势菌种，酵母菌和芽孢杆菌相对来说较少。
2、 菌落与菌体特征
全部菌株菌落形态基本相似，为生长状况良好、边缘光滑整齐、乳白色、凸起的圆形菌落；只有菌株WL7-1和WSo7-1颜色为微白色，WL7-1生长状况较差；菌株直径在0.8～2.0 mm之间。菌株WR7-1为球状，WSt5-2、WSt6-3、WSt6-4、WL7-1为椭圆状，其余为杆状。
3、 生理生化实验结果
18 株菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、明胶液化阴性、硝酸盐还原阴性，产酸性能较好。WL7-1和WFr5-1产气，其余菌株不产气。在耐酸实验中，随着生长环境pH值的升高，菌种生长状况逐渐变好，在pH 7.0时长势最好；WSo7-1、WSo7-2、WSt5-2、WSt6-3和WSt6-4耐酸效果较好。在耐盐实验中，菌种在3.0% NaCl和6.5% NaCl环境下长势基本较好；但是WR7-1菌种在含有6.5% NaCl的培养基中不能正常生长。在耐温实验中，所有菌种在5、45 ℃和50 ℃环境下不能正常生长；在10 ℃环境下WL7-1、WSo7-1、WSt5-4、WSt6-3、WFr5-1、WR5-2能够生长，WSt5-2和WSt6-4长势较好，说明这两株菌耐低温性能较好，其余菌株不能正常生长。
4、 实验菌株糖类发酵实验结果
WR7-1是唯一菌体特征为球形成对的菌株，同时它的生长曲线和产酸速率曲线较平缓，比较特殊；WFl5-3菌株生长形势较突出，产酸性能较好，同时此菌株的生理生化实验结果和其他大多数菌株相似；WL7-3和WFr6-4菌株的延迟期较短，比其他菌株能够快速适应环境，快速进入对数期和稳定期；WSt6-4菌株长势和产酸量较好，同时耐酸耐低温性能较好。
5、 乳酸菌生长速率测定结果
接种后菌种有短暂的延滞期，过后很快进入对数期生长，14 h 后进入稳定期，生长速率减缓，菌种量基本保持恒定；整体趋向“S”型。可以看出，WFr6-4相比其他菌种在对数期长势较快，WR7-1在对数期长势较平缓；达到稳定期后，WFl5-3长势最好，WR7-1长势较差。
6、 乳酸菌产酸速率测定结果
随着菌种生长速率增加，产酸速率同时增加，在4 h后，各菌种产酸量明显增加，pH值明显下降；12 h后，产酸量基本恒定。对各菌种进行比较可知，WFr6-4产酸速率较大，WFl5-3产酸能力较强，WR7-1产酸速率较缓和，产酸量较差。
7、16S rDNA序列同源性分析
乳酸菌16S rDNA片段PCR扩增结果
结果可知，各菌株在1 500 bp处出现单一荧光条带，而且没有明显拖尾现象，符合测序需要。
乳酸菌16S rDNA序列同源性对比结果
WFl5-3和戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）同源性最高，WL7-3和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）同源性最高，WSt6-4和植物乳杆菌（Lactobacillus sp. SMG131）同源性最高，WFr6-4和植物乳杆菌（Lactobacillus sp.Sy1）同源性最高，WR7-1和酪黄肠球菌（Enterococcus casseliflavus）同源性最高。所有菌种的同源性均达到99%以上，和标准菌株序列覆盖率均达到99%以上，E值都为0.0。
8、系统发育树的构建
WFl5-3和戊糖乳杆菌（L. pentosus）系统位置最近，WL7-3和植物乳杆菌（L. plantarum）系统位置最近，WSt6-4和植物乳杆菌（Lactobacillus sp. SMG131）系统位置最近，WFr6-4和植物乳杆菌（Lactobacillus sp. Sy1）系统位置最近，WR7-1和酪黄肠球菌（E. casseliflavus）系统位置最近。根据16S rDNA序列同源性对比和系统发育树的构建，可以得到：WL7-3、WSt6-4和WFr6-4鉴定为植物乳杆菌（L. plantarum），WFl5-3鉴定为戊糖乳杆菌（L. pentosus），WR7-1鉴定为酪黄肠球菌（E. casseliflavus）。
结 论
本研究从海南省五指山上野生香蕉植株上6 个部位共筛出44 株乳酸菌疑似菌株，排除5 株过氧化氢酶实验阳性菌株。从剩下的39 株菌种中挑选18 株进行镜检、生理生化实验、糖发酵实验、生长速率测定实验和产酸速率实验。根据结果选出5 株代表菌株，对其进行测序、同源性分析和系统发育树的构建。结果显示：5 株代表性菌株中有3 株为植物乳杆菌（L. plantarum）、1 株为戊糖乳杆菌（L. pentosus）、1 株为酪黄肠球菌（E.casseliflavus）。由此可见，在香蕉植株上乳杆菌属菌种为优势菌种。5 株代表菌株的产酸性能很好，可作为潜在益生菌株作进一步系统研究，能够扩大植物源乳酸菌菌种库，乳酸菌种类较为多样，而且抑菌效果较好。
目前已有学者对香蕉植株部分部位及其他热带植物进行了研究，本研究全面研究了香蕉植株上乳酸菌的多样性及分布，扩大了植物源乳酸菌菌种库，能够为今后的食品发酵工业和青贮饲料发酵业等提供植物源乳酸菌。但是香蕉的品种和种植地区都会对乳酸菌的多样性产生影响，今后要对不同地区不同品种的香蕉植株进行研究，了解相应的乳酸菌多样性，努力建立完善的体系，扩大热带乳酸菌菌种库。
