做分子克隆，构建表达载体的过程中，目的片段必须跟genebank 中的序列完全一致才行，所以在 PCR 过程中酶的选择首先应选择高保真酶，尤其是当目的片段较长的时候更是如此。这样才能在 PCR 过程中减少错配情况。高保真酶常常对退火温度有要求，对一般的酶来说，退火温度是 Tm-5 度，但如 NEB 的高保真酶的退火温度是 Tm 值+3 度。PCR 循环数不宜太大，20-30 即可。我就曾经用普通的酶进行过 PCR，扩增时出现非特异条带，T-A 克隆后送去测序，发现碱基有错配，而且每次都不一样。
二、PCR 产物直接酶切后连接不成功
当你获得 PCR 产物后，首先是进行纯化、酶切、纯化，然后与酶切后胶回收的载体连接，如果连接成功，当然是恭喜了。但往往会出现连接不成功的，原因以 PCR 产物没有酶切成功可能性大，这可能与引物设计的好坏有关。因为这个时
候 PCR 产物是否酶切成功是无法鉴定的，所以你反复尝试几次还不成功的话，就赶紧做个 T-A 克隆吧
三、T-A 克隆应注意的问题
T-A 克隆应该时间很简单的事，但知者不难，难者不知啊，还是有很多问题
要注意的。T-A 阳性率高，简单易操作，所以在质粒构建过程常常用来选择做为一个亚克隆，既可以用来测序，又有利于进一步酶切，确实很方便。但要注意，首先是 T 载体的选择，尽量避免选择含有目的片段酶切位点的 T 载体，这样会切成多个片段，有时候可能对后面的胶回收会有影响。其次，因为在 PCR 产物是用高保真酶扩增的，所以首先要进行加 A 反应。这时候应购买 T-A 快速克隆平末端加A 试剂盒。进行加 A 时反应体系不要太小，因为太小是酶量加的可能不准确。我开始就是这样，想着节约，说明书写的是 PCR 产物加 15ul,我没舍得，加了 3ul,加A 反应液、酶都相应减量，后面就是转化不成功。后来我 PCR 产物加为 6ul,就成
功了，屡试不爽。最后，在连接产物加入感受态细胞后，轻弹混匀，稍微离心一下，不要剧烈的震荡，反正我失败的时候都是力度较大，也不知道有没有关系。
四、菌液 PCR
T-A 克隆成功后，你可以看到很多蓝白斑，一般来说蓝斑要比白斑稍多。不是每个白斑都是你要的东西，下面就是阳性克隆的筛选了。挑白斑到摇菌管过夜摇菌，然后进行菌液 PCR。关于菌液 PCR 引物的问题，有的人用克隆引物，有的人用专门设计的检测引物，两者我都用过，只要检测引物能 P 出来，克隆引物也能 P出来，完全符合，所以一般的时候用克隆引物就可以了，除非运气不好，真好在起始点就出现错配的情况。
五、碱法小提质粒
挑取阳性克隆的菌液，抽提质粒吧。既然是小提，就不要很多菌液，一管就够了，3-5 毫升，开始以为菌液越多越好，其实是错的，首先这点菌液提的质粒够你测序及酶切用了，其次加多了反而不好，因为加的裂解液是相对固定的，多了
可能裂解不完全啊。提取质粒有传统的自己配制的酚氯仿抽提，也可以购买试剂盒。我还是倾向于用试剂盒，尤其是像我们这些并不打算在实验方面有所专长的初学者。国产的试剂盒很便宜，如天根的质粒小提试剂盒，一次大约也就 4 块钱，足够用的了。而用酚氯仿抽提吧，很容易出现质粒不纯的情况，在测序时无法测出信号。当然，这也可能跟个人有关，师姐们都建议后者，在他们看来，简单实用，价格更便宜。如何选择，就看自己的了。
六、酶切胶回收
测序结果正确的话那就恭喜你了，至少你已经拿到了目的片段，下面就酶切胶回收吧。将目的片段及载体进行酶切，并行酶失活，然后电泳胶回收。我回收过几次，但回收效率不高，也不知是什么原因。跑胶时条带很亮，酶切也很充分，
但一回收就没了，尤其是目的片段常常都看不到。很郁闷，这时候我多做了两个酶切回收体系，同时进行胶回收，加大量回收后跑电泳总算能看到目的片段了，虽说不亮，但总算有。个人认为，将 50ul 的酶切体系不要放在一个孔里面跑胶而是分成两到三个孔跑胶然后回收可能会增加回收的效率。
七、酶切产物连接
载体与目的片段的摩尔比常常为 1：3-10，但酶切回收后的产物测浓度常常测不出来。怎么去按这个比例进行连接反应呢。回收后将目的片段和载体同时跑胶比较亮度，根据亮度的比较再结合分子量来确定两者的体积比。如亮度比为 5：
1，两者的分子量比 10：1，体积比大约为 1：3. 不要担心产物的浓度低会影响连接，其实连接只要那么一点点就够了。我的阳性对照加的质粒只有 0.1ng，结果菌落长得满满的。
八、挑取阳性克隆送测序
转化成功后挑取阳性克隆的菌液进行质粒小提，同时保存菌种，送测序。
